Ligatie Rekenmachine

Categorie: Biologie
- 04 april 2025
| |

Vector DNA

Insert DNA

Ligation Reactie Opstelling

Aanbevolen Insert Hoeveelheid
8.3 ng
0.33 μL van insert voorraad
Vector Hoeveelheid
50 ng
Gebruik 1 μL van vector voorraad
Insert:Vector Verhouding
3:1 (molaire)
Optimaal voor standaard kloning

Volledige Reactie Opstelling

Component Volume (μL) Eind Hoeveelheid
Vector DNA (50 ng/μL) 1.0 50 ng
Insert DNA (25 ng/μL) 0.33 8.3 ng
10× T4 DNA Ligase Buffer 2.0 1×
T4 DNA Ligase 1.0 400 U
Nuclease-vrij Water 15.67 Tot 20 μL
Totaal Volume 20.0

Optimalisatie Tips

Op basis van uw invoerparameters, hier zijn enkele aanbevelingen:

  • Voor 5' plakkerige einden met een vector:insert verhouding van 1:3, incubeer bij 16°C gedurende 4 uur.
  • CIP-behandeling van de vector zal helpen om zelf-ligation achtergrond te verminderen.
  • Als de transformatie-efficiëntie laag is, probeer de insert:vector verhouding te verhogen naar 5:1.
  • Voor stomp eind ligaties, verhoog de ligase concentratie en verleng de ligatie tijd.
  • Verhit de ligase inactief bij 65°C gedurende 10 minuten voor de beste resultaten voor transformatie.

Over DNA Ligation

  • DNA ligatie omvat het samenvoegen van DNA-fragmenten door de vorming van fosfodiësterbindingen.
  • T4 DNA ligase vereist ATP en Mg²⁺ om goed te functioneren (geleverd in de ligatiebuffer).
  • Plakkerige eind ligaties zijn efficiënter dan stomp eind ligaties.
  • Vector:insert molaire verhoudingen variëren doorgaans van 1:3 tot 1:5 voor standaard kloning.
  • Hogere insert:vector verhoudingen (3:1 tot 10:1) worden aanbevolen voor stomp eind ligaties of grotere inserts.
  • Dephosphorylatie van vectoren (met CIP, SAP, enz.) voorkomt zelf-ligation van de vector.
  • Snelle ligase systemen kunnen de ligatie tijd verminderen tot 5-15 minuten bij kamertemperatuur.

Formule voor Invoeren Hoeveelheid (ng):

\[ \text{Invoeren ng} = \left( \frac{\text{Vector ng} \times \text{Invoeren grootte in kb}}{\text{Vector grootte in kb}} \right) \times \left( \frac{\text{Invoeren molen}}{\text{Vector molen}} \right) \]

Wat is de Ligation Calculator?

De Ligation Calculator is een hulpmiddel dat onderzoekers helpt de juiste hoeveelheid vector- en invoer-DNA te bepalen die nodig is voor een succesvolle ligatie-reactie. DNA-ligatie is een cruciale stap in moleculaire klonering, waarbij een DNA-invoeging wordt samengevoegd met een plasmidevector met behulp van een enzym genaamd DNA-ligase.

Hoe Werkt Het?

Deze calculator stelt gebruikers in staat om details over hun vector en invoer in te voeren, inclusief lengte en concentratie. Op basis van de gekozen molaire verhouding berekent het de vereiste hoeveelheid invoer-DNA om een optimale ligatie-reactie te bereiken.

Belangrijkste Kenmerken

  • Berekeningen van molaire verhoudingen tussen vector en invoer voor verschillende kloningscenario's.
  • Ondersteunt zowel standaard als aangepaste molaire verhoudingen.
  • Biedt aanbevelingen voor ligatieomstandigheden op basis van plakkerige of stomp-eind klonering.
  • Bevat optimalisatietips voor het verbeteren van de ligatie-efficiëntie.

Hoe de Calculator te Gebruiken

  1. Voer de vectorlengte (bp) en concentratie (ng/μL) in.
  2. Voer de invoerlengte (bp) en concentratie (ng/μL) in.
  3. Selecteer de gewenste molaire verhouding tussen vector en invoer (bijv. 1:3, 1:5).
  4. Specificeer het totale reactievermogen (bijv. 20 μL).
  5. Voor geavanceerde instellingen, kies ligatietemperatuur, duur, type ligase en vectorbehandelingsopties.
  6. Klik op “Bereken” om de aanbevolen invoerhoeveelheid en reactietoevoeging te genereren.

Veelgestelde Vragen

Wat is de optimale molaire verhouding tussen vector en invoer?

Voor plakkerige-eind ligaties wordt meestal een verhouding van 1:3 of 1:5 aanbevolen. Voor stomp-eind ligaties kan een hogere verhouding (bijv. 1:5 tot 1:10) de efficiëntie verbeteren.

Waarom wordt vector-de-fosforylering aanbevolen?

De-fosforylering (met CIP, SAP of Antarctic Phosphatase) voorkomt zelf-ligatie van de vector, waardoor ongewenste achtergrondkolonies worden verminderd.

Welke ligatieomstandigheden moet ik gebruiken?

  • 16°C gedurende 4 uur – Standaardconditie voor T4 DNA-ligase.
  • Kamer temperatuur gedurende 15 minuten – Geschikt voor Quick Ligase.
  • Een nacht bij 16°C – Aanbevolen voor uitdagende ligaties of stomp-eind klonering.

Hoe kan ik de ligatie-efficiëntie verbeteren?

  • Zorg voor de juiste molaire verhouding voor vector en invoer.
  • Gebruik verse DNA-ligase en buffer.
  • Optimaliseer ligatieomstandigheden (temperatuur en duur).
  • Bevestig de aanwezigheid van de invoer via gelelektroforese vóór ligatie.

Waarom Deze Calculator Gebruiken?

Deze Ligation Calculator vereenvoudigt de opzet van DNA-ligatiereacties, waardoor onderzoekers de juiste hoeveelheden vector en invoer voor efficiënte klonering kunnen bepalen. Door berekeningen te automatiseren en optimalisatietips te bieden, bespaart het tijd en verhoogt het de slagingskans van ligatie-experimenten.